​3月23日，北京大学IDG麦戈文脑科学研究所邀请浙江大学陈家明教授，在金光楼邓祐才报告厅作了精彩的学术报告，标题为“Immunogenic Cell Death: The Good, the Bad and the Ugly”。陈良怡教授主持报告会。本期学术笔记由该报告整理而成。

　　陈家明教授探讨了坏死性凋亡的信号通路，以及它在组织复修，和各类炎症疾病中的功能。

　　TNF（肿瘤坏死因子）能够抑制肿瘤的生长（图1）。与此同时使用TNF治疗的病人也会变得十分消瘦。TNF会激活NF-κB 可以触发了另一种形式的细胞死亡也就是坏死性凋亡（necroptosis）。坏死性凋亡是细胞死亡的一种溶解性和炎症性形式。

　　图1. 病人在使用TNF治疗之后（右侧）面部肿瘤生长受到抑制。

　　细胞坏死需要RIPK1-RIPK3-MKL轴的参与（如图2C）。RIPK1包含两个重要的结构N-端激酶结构域以及RIP同型相互作用模块 (RHIM)。RIPK1和RIPK3之间通过RHIM的同型相互作用形成坏死小体复合物，从而通过磷酸化级联激活MLKL。磷酸化MLKL发生低聚并迁移到质膜，在那里它通过引发膜破裂来诱导坏死。一般情况下不会发生细胞坏死。但当caspase8被抑制时，才会激活RIPK1和RIP3引发的坏死性凋亡过程[1]。

　　除此之外, RIPK3/MKL依赖性的坏死性凋亡能够被TLRs（Toll-like receptors,TLR）或者病毒激活。给小鼠注射病毒会诱导TNF的产生（图3B），RIPK1-RIPK3的产生(图3A)以及组织的细胞坏死（图3C）。RIP3缺陷小鼠表现出严重受损的病毒诱导的组织坏死、炎症和病毒复制控。因此，RIP3 通过启动促坏死激酶级联控制程序性坏死，该级联对于针对病毒感染的先天炎症反应至关重要[2]。

　　图2. TNF可诱发坏死性凋亡

　　图3. RIP3依赖性程序性坏死是控制痘苗病毒在体内复制所必需的

　　B：病毒感染野生型和RIP3敲除小鼠。感染后24小时在腹膜渗出细胞中检测到TNF表达。

　　C：在野生型小鼠中，VV感染导致内脏脂肪垫中以中性粒细胞/巨噬细胞浸润为标志的炎症（图3C，红色箭头），而RIP3敲除小鼠中明显不存在这种炎症

　　E: 病毒感染的肝脏中RIP1-RIP3复合物的形成。

　　F: 在感染后第3天测定RIP3野生型和RIP3敲除鼠内脏脂肪垫、肝脏和脾脏中的病毒滴度。

　　G:VV感染RIP3野生型和RIP3敲除鼠的生存图。

　　牛痘病毒是一种非常古老的病毒，有高度的免疫原性，但会引起相对良性的疾病，曾被用来大范围地接种。陈家明团队经检测发现，牛痘病毒（CPXV）对TBZ诱导的坏死具有耐受性（图4）这种耐性是由于RIPK3的降解导致的（图5）。为了进一步探究背后的机制，陈家明团队对牛痘病毒基因进行集中的siRNA筛选，筛选出了CPXV006基因，它编码一种在N末端有六个锚蛋白重复序列和一个C末端F-Box的蛋白质（图6A）。该基因被命名为vIRD。删除vIRD完全阻止了CPXV诱导的RIPK3降解（图6B）。感染CPXV-ΔvIRD的L929细胞发生自分泌TNF诱导的坏死（图6C）。随后作者证明vIRD诱导的RIPK3降解需要依赖SCF（SKP1-Cullin1-Fbox）复合物

　　哺乳动物F-box蛋白作为衔接蛋白，将蛋白质底物募集到SKP1-Cullin1-Fbox（SCF）复合物中，这是一种促进蛋白质泛素化和蛋白酶体降解的多亚基复合物[3]。CPXV感染诱导了vIRD、SKP1和CUL1之间的特异性相互作用（图6E）。

　　siRNA对CUL1的沉默逆转了CPXV诱导的RIPK3降解，并恢复了对自分泌TNF诱导的坏死的敏感性（图6F-G）。SCF活性由CUL1烯二基化激活[4]。抑制剂MLN4924有 效地将所有细胞CUL1转化为快速迁移的非活性形式，逆转了CPXV诱导的RIPK3降解，并恢复了CPXV诱发的L929细胞对坏死的敏感性（图6H）。在MLN4924存在的情况下，抗TNF中和抗体部分抑制了CPXV介导的细胞死亡。这些结果表明：vIRD以SCF依赖的方式靶向RIPK3降解以抑制TNF、RIPK1和RIPK3诱导的坏死[5]。

　　图4. 牛痘病毒感染细胞对坏死凋亡具有抗性（TBZ处理会诱导典型的坏死性凋亡）

　　图5. vIRD触发了RIPK3蛋白的降解

　　图6. vIRD与细胞SCF复合物组分相互作用，以促进RIPK3降解和坏死抗性

　　（A）来自CPXV的vIRD的结构域组织示意图以及来自VACV Western Reserve和Copenhagen菌株的截短vIRD直向同源物。

　　（B） 通过蛋白质印迹分析用WT或指示的突变体CPXV感染的L929细胞的RIPK3表达。

　　（C） vIRD对于感染CPXV的细胞的坏死抵抗是必不可少的。使用Incucyte监测感染VACV、vIRD缺失的CPXV（CPXV-ΔvIRD）或vIRD回复体（CPXV-WT）的L929细胞的细胞死亡。结果为平均值±SEM。

　　（D） 在CPXV感染后的指定时间，通过蛋白质印迹测定vIRD表达和RIPK3降解的动力学。

　　（E） 病毒SCF复合物的形成。SKP1是从CPXV感染的和未感染的L929细胞中免疫沉淀的。通过蛋白质印迹测定CPXV感染后的vIRD和CUL1募集。

　　（F） CUL1对CPXV诱导的RIPK3降解至关重要。通过蛋白质印迹监测用CUL1特异性或对照扰乱的siRNA转染的L929细胞的RIPK3降解。

　　（G） CUL1对于CPXV介导的对坏死的抵抗是必不可少的。通过Incucyte活细胞成像监测用指示的siRNA转染的L929细胞的细胞死亡。结果为平均值±SEM。

　　（H） CUL1 nedylation对CPXV诱导的RIPK3降解的影响。用MLN4924处理未感染或CPXV感染的L929细胞。通过蛋白质印迹法测定vIRD和RIPK3的表达。

　　图7. vIRD的锚蛋白重复序列介导与RIPK3的结合

　　（A） 使用的vIRD突变体的示意图。

　　（B） 用指示的GFP标记的vIRD和RIPK3转染HEK293T细胞。使用所指示的抗体进行免疫沉淀和蛋白质印迹。

　　以上，陈家明团队从牛痘病毒中筛选到一个可以降解RIPK3的分子，称为vIRD。vIRD基因通过ankyrin结构域结合RIPK3，通过F-Box 结构域与SKP1和Cullin1形成SCF（SKP1-Cullin1-Fbox）复合物介导了RIPK3的降解，从而对细胞坏死产生耐性（图8）。

　　图8. vIRD介导细胞坏死抗性重要结构域

　　除此之外，陈教授团队发现细胞坏死性凋亡能够免疫保护小鼠应对肿瘤挑战。并且RIPK3在诱导细胞死亡的同时，也在组织再生中发挥关键作用。当树突细胞Ripk3失活小鼠受到DSS处理诱发结肠炎时，它们表现出比同窝出生的野生型小鼠更严重的体重减轻和结肠缩短（图9B–C）。树突细胞Ripk3失活小鼠在DSS治疗后的结肠中产生的IL-22（组织修复的关键启动子）比同窝对照显著减少（图9D）[6]。

　　图9. 树突细胞特异性缺失RIPK3 RHIM对DSS诱导的大肠炎具有保护作用

　　B: DSS处理小鼠体重示意图。Ripk3-gfpfl/fl表示携带GFP报告基因的小鼠；CD11c:Ripk3-gfpfl/fl表示小鼠Ripk3 基因RHIM domain失活。

　　C：DSS处理小鼠结肠长度示意图。

　　D：组织修复关健启动子表达水平示意图。

　   撰文：牛梦晓

　　审核：陈良怡

　　参考文献

　　[1] Roberts JZ, Crawford N, Longley DB. The role of Ubiquitination in Apoptosis and Necroptosis. Cell Death Differ. 2022 Feb;29(2):272-284. doi: 10.1038/s41418-021-00922-9. Epub 2021 Dec 15. PMID: 34912054; PMCID: PMC8817035.

　　[2]Cho YS, Challa S, Moquin D, Genga R, Ray TD, Guildford M, Chan FK. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 2009 Jun 12;137(6):1112-23. doi: 10.1016/j.cell.2009.05.037. PMID: 19524513; PMCID: PMC2727676。

　　[3]Lee EK, Diehl JA. SCFs in the new millennium. Oncogene. 2014 Apr 17;33(16):2011-8. doi: 10.1038/onc.2013.144. Epub 2013 Apr 29. PMID: 23624913.

　　[4]Enchev RI, Schulman BA, Peter M. Protein neddylation: beyond cullin-RING ligases. Nat Rev Mol Cell Biol. 2015 Jan;16(1):30-44. doi: 10.1038/nrm3919. PMID: 25531226; PMCID: PMC5131867.

　　[5]Liu Z, Nailwal H, Rector J, Rahman MM, Sam R, McFadden G, Chan FK. A class of viral inducer of degradation of the necroptosis adaptor RIPK3 regulates virus-induced inflammation. Immunity. 2021 Feb 9;54(2):247-258.e7. doi: 10.1016/j.immuni.2020.11.020. Epub 2021 Jan 13. PMID: 33444549; PMCID: PMC7878414.SCF

　　[6] Moriwaki K, Balaji S, Bertin J, Gough PJ, Chan FK. Distinct Kinase-Independent Role of RIPK3 in CD11c+ Mononuclear Phagocytes in Cytokine-Induced Tissue Repair. Cell Rep. 2017 Mar 7;18(10):2441-2451. doi: 10.1016/j.celrep.2017.02.015. PMID: 28273458; PMCID: PMC5343671