2021年11月6至7日，北京大学IDG麦戈文脑科学研究所成立十周年庆典暨北京大学脑科学国际论坛成功举办。来自美国哈佛大学、斯坦福大学、加州大学伯克利分校、英国伦敦大学学院、德国马普研究所、日本筑波大学、北京师范大学、中科院脑智卓越创新中心等国内外高校和科研机构的知名学者，从分子、细胞、环路、系统、认知、心理、计算、神经精神疾病等多个层面和角度，热情分享了他们在脑科学前沿研究的最新进展，并与线上线下观众频繁互动，在思维的碰撞中激荡出创新的火花。现陆续推出相关学术笔记，让我们重温精彩再出发！

　　本期推出的学术笔记，根据北京大学IDG麦戈文脑科学研究所、生命科学学院李毓龙教授所作的题为“Spying on neuromodulation by constructing a toolbox of genetically encoded fluorescent sensors”的报告整理而成。

　　李毓龙教授作报告并与嘉宾观众交流

　　撰稿：卓一洲

　　审核：李毓龙

　　大脑复杂功能的实现离不开神经元之间高效特异的信息交流和整合。神经调质作为重要的生物小分子，参与了神经元间化学突触介导的信息传递过程。已知的重要神经调质如单胺类、脂类及神经肽类等参与了包括发育、信息感知、运动调节以及大脑高级认知行为等多种生理学功能。与其重要性相对应，神经调质的功能异常也与神经退行性疾病、成瘾、癫痫、抑郁症及精神分裂病等疾病相关。

　　因此，了解大脑功能背后的工作机理离不开对于神经调质的研究。然而，传统的测量手段难以实现以高灵敏度、高时空分辨率、直接检测在体特定神经调质分子动态变化。为克服神经调质检测的技术瓶颈，李毓龙课题组设计了GRAB探针策略 (GPCR activation-based sensor)，基于神经调质分子特异的G蛋白偶联受体和构象敏感的循环重排荧光蛋白开发了一系列新型荧光成像探针，用于在高时间和空间尺度上解析复杂神经系统的功能。

　　李毓龙教授首先介绍了其课题组在开发内源大麻素探针的工作。人类历史上，大麻已被驯化并使用了数千年。《神农本草经》中记载：“麻蕡（即大麻果实），味辛平。主五劳七伤，利五脏，下血，寒气。多食，令人见鬼，狂走。久服，通神明，轻身”，这不仅介绍了大麻的药学功效，还描述了人摄入大麻所引发的幻觉等精神活动的变化。古书上所记载的大麻对人精神活动的影响是由其天然成分大麻素类分子进入人体后作用在内源大麻素系统而实现的。内源大麻素（endocannabinoids, eCBs），包括花生四烯酸甘油酯（2-AG） 和花生四烯酸乙醇胺 （AEA），是由神经元合成和释放的一类脂类神经调质分子。与经典神经递质不同的是，eCB在突触后神经元释放，逆行性地作用在特定类型神经元突触前膜大麻素受体CB1R上，发挥突触前抑制作用。eCB参与突触可塑性调节，对维持神经系统的正常功能至关重要，与奖赏行为、能量代谢、学习记忆、睡眠觉醒、情绪等多种生理过程密切相关。内源大麻素系统的调控异常也与神经退行性疾病、癫痫、成瘾、抑郁症和精神分裂症等诸多神经疾病和精神类疾病密切相关。然而，目前缺乏高灵敏度、高时空分辨率的实验手段直接检测在体eCB的动态变化，极大地限制了人们对其在生理和病理状态下重要功能和分子调控机理的研究。

　　李毓龙课题组利用GRAB原理，基于人源大麻素受体CB1R开发的内源大麻素探针eCB2.0。在体外培养的HEK293T细胞和原代神经元中，eCB2.0探针均表现出良好的细胞膜定位，对外源加入的大麻素AEA和2-AG有亚微摩至微摩级的亲和度，秒级的动力学响应和高度的分子特异性。在原代培养的大鼠神经元中，eCB2.0能够检测到电刺激引发的内源eCB释放，结合药理学手段可知其释放类型主要为2-AG。在急性脑片这一更接近生理条件的体系中，电刺激和高钾溶液刺激均能引起较快的eCB释放。同时，在不给予外加刺激时，eCB2.0也能以单个突触的空间分辨率检测到离散分布的自发性eCB释放信号。

  在活体小鼠中，结合光纤记录手段，表达在小鼠基底外侧杏仁核(BLA)的eCB2.0探针可成功检测到光激活引发的eCB释放信号以及给予小鼠足部电击时BLA脑区的eCB信号。另一方面，通过活体双光子双色显微成像同时记录小鼠癫痫发作时海马体CA1脑区神经元的钙信号和eCB信号，发现癫痫发生时小鼠海马体CA1区神经元表现出水平传递的“钙波”信号并伴随强烈的“eCB波“信号，推测eCB在癫痫发生时通过突触前抑制起到神经元保护作用。此外，为了更好的区分2-AG和AEA，李毓龙团队与宋晨团队合作，基于CB1R结构信息以及2-AG和AEA头部基团差异，进一步对探针受体骨架进行理性突变设计得到分子选择性增强的2-AG探针和AEA探针，可用于进一步特异解析两种eCB在各种生理病理过程中的功能异同。

　　除了介绍新一代的内源大麻素探针外，李毓龙教授还介绍了其团队一项还未发表的工作，即：新一代神经肽类神经递质探针的开发。先前研究表明，神经肽类分子——催产素(oxytocin, OXT)在择偶、母性行为与自闭症等生理病理过程中发挥重要作用，但对其功能实现的分子调控机制和释放机制仍然知之甚少。为此，李毓龙课题组运用类似的GPCR探针策略拓展开发了用于检测催产素的新型荧光探针OXT1.0。在体外培养的HEK239T细胞和原代培养神经元中，OXT1.0均表现出优异的细胞膜定位，并对外源加入的OXT具有超过400%信号响应，~10nM的亲和力及高度分子特异性。

　　与经典小分子神经递质释放机制的研究相比，人们对于神经肽类的释放机制却知之甚少。李毓龙教授还分享了他们结合新型神经肽类探针和操作手段，在研究神经肽类释放机制方面的进展。催产素能神经元胞体主要位于室旁核(paraventricular nucleus; PVN)，其轴突广泛投射于包含腹侧被盖区(ventral tegmental area; VTA)在内的多个脑区。在小鼠急性脑片中，表达在PVN的OXT1.0探针可以检测到电刺激引发的胞体或树突OXT释放信号，同时，表达在VTA的探针也能够检测到相同刺激条件下轴突释放的OXT。后续药理学实验及突变型探针实验进一步验证了OXT1.0检测信号的特异性。有趣的是，他们发现与传统小囊泡介导的谷氨酸释放信号相比，致密核心大囊泡（large dense-core vesicle, LDCV）介导释放的OXT信号具有较慢的动力学特征。为了进一步研究催产素的释放机制，他们通过药理学手段探索了多种钙离子通道在神经元不同部位OXT释放中的参与作用，并发现PVN脑区胞体或树突的OXT释放主要依赖L型钙离子通道；而VTA脑区OXT轴突释放则依赖于N型钙离子通道。此外，课题组也进一步揭示催产素在神经元不同部位的Ca2+依赖性释放存在特异的膜融合机制，其中，SNAP25参与轴突/树突部位OXT释放过程，而其轴突释放则取决于SNAP25与VAMP2的共同参与作用。

　　考虑到OXT在择偶过程的重要作用，为了研究活体动物在交配行为过程中OXT动态变化，李毓龙课题组与罗敏敏课题组合作借助AAV病毒在小鼠PVN, VTA与前额叶皮层（prefrontal cortex; PFC)三个脑区同时表达OXT1.0探针，并使用光纤记录手段检测到在小鼠交配行为的不同阶段中存在脑区特异的OXT动态变化。

　　除了以上两项工作外，李毓龙教授还介绍了其课题组探针开发的最新进展，包括用于检测组胺（HA）、三磷酸腺苷（ATP）等神经调质的新型荧光探针，以及新一代可用于多色成像的红色多巴胺（DA）和五羟色胺（5-HT）探针。这一系列新型成像工具的开发为解析大脑复杂神经环路奠定了方法学基础，将助力科学家更加深入地研究神经调质信号在生理病理状态下的功能机制。

　　参考文献

　　1. Dong, A., He, K., Dudok, B., Farrell, J.S., Guan, W., Liput, D.J., Puhl, H.L., Cai, R., Wang, H., Duan, J., et al. (2021). A fluorescent sensor for spatiotemporally resolved imaging of endocannabinoid dynamics in vivo. Nat. Biotechnol. 1–12.

　　2. Wu, Z., He, K., Chen, Y., Li, H., Pan, S., Li, B., Liu, T., Xi, F., Deng, F., Wang, H., et al. (2021). A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATP in vitro and in vivo. Neuron.