报告人：Craig Forest，Ph.D

整理人：董傲

审核人：李毓龙

　　2017年5月24日下午，来自美国佐治亚理工的Craig Forest教授受IDG/麦戈文脑研究所的李毓龙研究员邀请来到北京大学，在王克桢楼1206会议室给大家带来了一场题为“Automated single-cell analysis of neurons in the living brain”的学术报告。Forest教授主要研究领域是生物医学微电子机械系统（Bio-MEMS）、机器设计、信号加工、光学和生物纳米领域前沿的仪器设备制造。本次讲座中，Forest教授主要介绍了由他们实验室开发的自动膜片钳记录技术和电极清理技术。

　　电生理技术是研究神经生物学，特别是研究神经元兴奋性、突触可塑性和离子通道性质等的金标准。1963年诺贝尔生理及医学奖获得者Sir John Carew Eccles，Alan Lloyd Hodgkin和Andrew Fielding Huxley使用电生理技术记录了乌贼大轴突上的离子流动，描述了神经系统兴奋性和抑制性的基本原理；1991诺贝尔生理及医学奖获得者Erwin Neher和Bert Sakmann优化了电生理膜片钳技术，记录到了细胞膜上单个离子通道的电流，从单分子角度阐明了的神经元的电学性质。直到今天，世界上还有众多实验室使用膜片钳技术研究神经生物学的诸多问题。但膜片钳仍存在一些技术上的局限性：一个实验操作者需要进行至少数月的训练才能熟练的进行膜片钳记录，并且封接成功率低、操作时间长、记录通量低。这在一定程度上限制了膜片钳技术的应用。

　　作为训练有素的工程师，Forest教授擅长开发程序算法和制造仪器，致力于解决膜片钳技术现有的不足。他与麻省理工的Edward Boyden教授合作开发了Autopatcher：在体自动膜片钳系统。 在体自动膜片钳系统能够在活体小鼠上，通过机器人手臂自动将电极定位到大脑特定位置，例如皮层或海马，再通过实时反馈电极电阻来判断电极状态，并自动对神经元进行封接、吸破，进而进行全细胞记录。经过估算，Autopatcher（32.9%）相比人工（28.8%）有相似的、甚至更高的在体全细胞记录成功率。这在一定程度上减少了人的工作量，提高了膜片钳记录的工作效率。

Autopatcher的原理、运行流程和记录范例

　　膜片钳记录常用的玻璃电极每个只能记录一个细胞，这是因为接触细胞后的电极末端被细胞膜等物质污染，难以再次和新的细胞形成良好的封接。Autopatcher虽然实现了从寻找细胞、封接、吸破和全细胞记录的全过程，但每记录一个细胞（无论成功与否），就需要实验人员手动更换一个新的玻璃电极。这就意味着一个实验人员需要一直待命，等待Autopatcher进行一个细胞的记录后手动更换电极，以便Autopatcher进行下一个细胞的记录。这显然不是一个高效的工作方式。

　　为了解决这一问题，Forest教授又开发了电极清理技术。这项技术能够实现玻璃电极的清洗和重复使用。为了清除使用过的电极尖端的污染物，机器人手臂将电极移出样品，置于一个含有去垢剂的清洁溶液中并反复吹打，这使得电极尖端能够被清洗干净；接着电极又被置于aCSF溶液中做进一步清理；最后给电极内部较高压力，使电极内液外流替换掉上述清洗溶液，完成电极的清洗。经过扫描电镜检测，清洗后的电极尖端污染物消失；质谱检测表明清洗后的电极内液没有残留去垢剂成分；膜片钳记录结果显示清洗后的电极封接、记录效果和新电极相似。这样的清洗-再使用平均来说可以重复10次，这也就意味着一根电极可以完成半天甚至一天的实验量。省去了频繁更换电极的时间，实验人员的工作效率也得到了进一步提高。

电极清理技术原理和效果展示

　　更为神奇的是，Forest教授实验室将自动膜片钳技术和电极清理技术结合到了一起，成功实现了电生理记录的全自动化。Autopatcher系统能够自动寻找细胞并进行记录，记录完成后机器人自动将电极进行清理，清理后的电极则可进行下一个神经元的自动记录。Forest教授在讲座中展示的全自动膜片钳实验视频令在场听众无一不印象深刻。他和大家开玩笑说，你只需要坐在家里，就可以拿到博士学位了！

　　Forest教授开发的自动膜片钳技术灵活性高，能够较为简单地扩展在已有的Axon电生理平台上，无需从头搭建。此外，这套系统不但适用于在体动物的记录，还适合于脑片和体外培养细胞的记录。除了通过实时反馈电极电阻来判断电极状态外，Autopatcher还能结合计算机视觉算法进行基于图像的（image based）自动膜片钳记录，从而让电极躲避障碍物（例如大脑中的血管），以及记录实验人员所关心的特定细胞。这能够在实现高效率、高通量的基础上，实现高特异性的细胞记录。

　　Forest教授等成立了Neuromatic Devices公司，致力于将Autopatcher技术服务于全世界的实验室。他强调，技术在研究科学问题中，常常发挥着比提出科学问题更重要的作用。讲座最后，在场老师同学与Forest教授对实验细节进行了充分的讨论，本次学术报告在热烈的氛围中圆满结束。

参考文献

1. Kodandaramaiah, Suhasa B., et al. "Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo." Nature methods 9.6 (2012): 585-587.

2. Kolb, I., et al. "Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse." Scientific reports 6 (2016).

3. Wu, Qiuyu, et al. "Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro." Journal of Neurophysiology 116.4 (2016): 1564-1578.